David Crowe
23 Nisan 2020
Versiyon 3

Bu, RT-PCR teknolojisine istinaden yapılan sözde koronavirüs testinin bir analizidir. Bu çalışma önemli ölçüde, dünya çapında bir uzman olan Profesör Stephen Bustin‘ın RT-PCR ile ilgili olası sorunlar üzerine olan 2017 tarihli bir makalesini okumama, son zamanlarda onunla birlikte yürüttüğüm bir podcast’e ve RT-PCR verilerinin işlenmesi ve raporlanmasına dair MIQE yönergelerine dayanmaktadır. Bu makale, testte kullanılan RNA’nın viral mi yoksa endojen mi olduğunu sorgulamamaktadır.  RNA viral değilse, RT-PCR koronavirüs testinin hiçbir değeri olmadığı açıktır. Bu belgede billimsel referans verilmemiştir, ilgili yayınlar için Koronavirüs Paniği Kritiği başlıklı yazımıza bakılmalıdır.

PCR DÖNGÜ SAYISI


PCR algoritması döngüseldir. Her döngüde DNA (RT-PCR içerisinde sürecin başlatıldığı RNA’ya karşılık gelen) miktarının yaklaşık iki katını üretir. Test olarak kullanıldığında, başlangıç ​​materyalinin miktarını bilmezsiniz fakat her döngünün sonundaki DNA miktarı problara bağlanan floresan moleküller tarafından dolaylı olarak gösterilecektir.O zaman her adımdan sonra üretilen ışık miktarı yaklaşık olarak iki katına çıkar ve belli bir yoğunluğa ulaşınca işlem sonlandırılır, numune pozitif ilan edilir (numunenin enfekte olduğu kastedilir). Belli bir döngü sayısına ulaştıktan sonra hala yeterli DNA yoksa numune negatif ilan edilir (enfekte olmadığı anlamında). Pozitif ve negatifi ayırmak için kullanılan bu döngü eşik değeri (Ct) keyfidir ve testi yapan her kuruluş için aynı değildir. Örneğin, 36’yı pozitif için sona erme noktası, 37-39’u belirsiz, yani daha fazla test yapılmasını gerektiren ve 39’u negatif olarak rapor eden bir makale yayınlandı. Başka bir çalışma ise, ara alan olmadan, kesme noktası olarak 37’yi kullandı. Amerikan FDA tarafından onaylanan test kitlerinin olduğu listede, 30, 31, 35, 36, 37, 38 ve 39 döngülerinin her biri için bir üretici önerisi vardı,12 üretici tarafından seçilen 40 döngü sayısı ise en popüler olandı, 43 ve 45 döngü sayıları için ise birer üretici önerisi mevcuttu.

DÖNGÜ EŞİK DEĞERİNİN (Ct) MANASI

Ct değeri kullanırken varsayılan şey, kullanılan RNA miktarı aslına yaklaşık olursa (iki ile çarpımda) yine aynı Ct değerini vereceğidir. Oysa RT-PCR’de birçok yoldan hata oluşabilmektedir. RNA ekstraksiyon aşaması bile verimde bir sürü kayba gebeyken, RNA’nın komplemeter DNA’ya dönüştürülmesi aşamasında etkinlik bakımından verilecek fire daha da büyüktür (Prof. Bustin’e göre yapılan işlemde etkinliğin %50’nin üstüne çıktığı pek vaki olmayıp, rahatlıkla 10 katlık fark oluşabilmektedir) ve tabii PCR işleminin bizzat kendisi etkinlikte kayba yol açmaktadır. Podcast yayınında Bustin, keyfi Ct değerine göre hareket etmenin “tamamen saçmalık” olduğunu, bunun “akıl alır tarafı olmadığı”nı belirtmiştir. Farklı laboratuvarlarda testlerin aynı Ct değerine göre yapılmış olması, başlangıçtaki RNA miktarının aynı olduğu anlamına gelmemektedir.

DÖNGÜ KONUSUNDAKİ KISITLAR

Profesör Bustin 35 kezden fazla döngü yapmanın amaca uygun olmadığını ve mantıksızlığını belirttiği halde, hiç kimsenin bu döngü sayılarını 35 ve altında sınırlandırmadığı görülmektedir (MIQE ilkeleri 40’tan az döngü sayısını önermektedir). Çok fazla döngü yapıldığında arka plan flüorışıma artacağı için, bu durum sahte pozitiflikle sonuçlanabilir.

CT ve POZİTİF ÇIKAN TEST SAYISI


Ct döngü değeri, pozitif testlerin sayısını önemli ölçüde etkileyecektir. Ct 37’den 35’e çekilirse daha az, 39’a çıkarılırsa da daha fazla pozitif sonuç elde edilecektir.

CT döngü değeri belli bir standarda bağlansa bile, farklı laboratuvarlar tarafından kullanılan özel makinalar, kimyasallar ve prosedürlere bağlı olarak farklı anlamlar taşıyabilirler ve hatta aynı laboratuvardaki farklı numune türleri arasında bile değişiklikler bulunabilir. Miktarı belli bir ‘spike’ RNA alınıp iki ayrı makinede eşzamanlı olarak çoğaltıma sokulup çıkan sonuç karşılaştırılmadan, pozitif ve negatifliği tutarlı bir biçimde birbirinden ayırmamızı sağlayacak Ct değerine ulaşılması zordur.

MİKTARIN BİR ANLAMI VAR MI?


Randımanlı bir PCR işleminde dahi oldukça yüksek döngü sayısına rağmen tespit edilen RNA molekülü sayısı topu topu 3’te kalabiliyor. Vücudunda, herhangi bir sağlık sorunu bulunmasa dahi bu kadarcık bir virüs bile taşıyan varsa, onlar da testte pozitif çıkmış oluyor.

VİRÜS FONKSİYONEL Mİ DEĞİL Mİ?


Alınan numunede enfeksiyon kabiliyeti olmayan defektif virüs partikülleri veya virüsün yalnızca bir bölümü varsa bile test yine pozitif verecektir. PCR testi ile virüsün patojenik ve replikasyon kabiliyetine sahip oluop olmadığı anlaşılamaz.

RT-PCR TESTİ İLE ENFEKTE KİŞİYİ ENFEKTE OLMAYANDAN AYIRMAK MÜMKÜN MÜ?

Değildir.

RT-PCR’NİN ÇALIŞMA MEKANİZMASI


PCR ile belli bir RNA’yı aramak için şu işlemler uygulanır:

  1. RNA’nın numuneden çıkarılması (ekstraksiyon) gerekir. DNA karışmamasına çok dikkat edilmeli, bu işlem titizlikle yürütülmelidir. İleriki aşamalarda testin çalışmasını engelleyecek kimyasalların kullanılmaması gerekir. Elde edilenin saf RNA olmasını sağlamak mümkün değildir.

  2. RNA’nın komplementer DNA’ya (cDNA) dönüştürülmesi gerekir. Ters Transkritaz enzimi vasıtasıyla yapılan bu işlem hiçbir zaman yüzde yüz etkin değildir (randıman %50’de kalır). Ortaya ne kadar DNA çıkacağı ise birçok faktöre göre değişiklik gösterir, miktarda 10 katlık farklar gözlemlenebilir (eskiden 100 kat daha az veya daha çok olabiliyordu miktar).

  3. İşin PCR kısmında, primerleri ve probuyla (ve muhtemelen yanında biraz da, ayıklanamadığı için numuneden karışmış kaçak DNA ile birlikte) cDNA vardır sahnede. Primerler, kopyası çıkarılarak çoğaltılmak istenen cDNA’nın başını-sonunu belirler. Prob ise, RNA’nın ancak primerlerle eşleştiği takdirde (ki primerlerin boyu çok çok kısadır) çoğaltıma gitmesini sağlamaya yarar. Her döngüde (PCR proper’da) DNA miktarı yaklaşık iki katına çıkar. Proba floresan marker’ler iliştirilir ki, verdiği ışıktan her adımda kaç DNA üretilmiş olduğu aşağı yukarı anlaşılabilsin.

  4. İstendiği takdirde, bu şekilde üretilmiş DNA sekanslanarak tam olarak hangi bazlardan (dört farklı DNA boncuğundan (bead) müteşekkil yapı) oluştuğu da görülebilir.

Bu işlemlerin her bir aşaması hataya ve randımansızlığa açıktır. Miktarı kestirmek ise reaksiyona başka bir RNA’dan belli bir miktar karıştırılmadan mümkün dahi değildir, kaldı ki o katılan RNA da sonra kopyalanıp çoğaltılmaya başlar. İlk başta elde ne kadar materyal varsa, PCR’nin yapacağı döngü sayısı da kabaca bunun azlığı veya çokluğu ile ilişkili olacaktır.

TESTLERİN SORUNLU OLDUĞU SALT BİR HİPOTEZDEN Mİ İBARET YOKSA ELDE KANIT VAR MI?

Bu testlerin çıkardığı imkansız sonuçları açıkça görebileceğimiz çok sayıda yayın bulunmakta.

Çin’de yapılan bir çalışmada araştırmacılar art arda yapılan test sonuçlarını Negatif (N), Pozitif (P) veya kuşkulu (D, negatif-pozitif arası bir noktada) şeklinde kodluyor. Test edilen 600 hastadan 29’unda çıkan şu sonuçlara hiçbir açıklama getirilemiyor: 1 DDPDD 2 NNPN 3 NNNPN 4 DNPN 5 NNDP 6 NDP 7 DNP 8 NDDPN 9 NNNDPN 10 NNPD 11 DNP 12 NNNP 13 PPNDPN 14 PNPPP 15 DPNPNN 16 PNNP 17 NPNPN 18 PNP 19 NPNP 20 PNPN 21 PNP 22 PNP 23 PNP 24 PNDDP 25 PNPNN 26 PNPP 27 PNP 28 PNPN 29 PNP. 

Singapur’da yapılan bir çalışmada, 18 hasta neredeyse her gün test ediliyor ve çoğu da en az bir kez önce Pozitif sonra Negatif ve ertesi gün tekrar Pozitif çıkıyor. Hatta bir hasta tam dört kez bu patterni gösteriyor.

Çin’de, birbirini izleyen iki negatif testin sonucunda temiz ilan edilen hastaların %5 ila %14 kadarı daha sonra yeniden, çoğunda semptom dahi yokken bir daha pozitif çıkıyor. Güney Kore’de de yakın zamanda bu tür 91 vaka bildirilmiştir. 

68 yaşında bir Çinli semptomları olduğu için hastaneye gidiyor ve testi pozitif çıkıyor. Semptomlar düzeldikten sonra iki negatif test de verince taburcu ediliyor. Bir süre sonraki takip testinde yeniden pozitif çıkınca hastaneye geri alınıyor, düzelince iki negatifle yeniden salınıyor, takip testi bir daha pozitif verince gene yatırılıyor ve ardından üçüncü kez taburcu ediliyor.

SONUÇ


Tüm bunlardan yola çıkarak şu sonucu söylemek mümkündür:

Koronavirüs tespiti için RT-PCR testi kullanımı, mümkün olduğunca çok sayıda pozitif sonuç üretmek için tasarlanmışa benzemektedir. Gerçek pozitifleri kaçırma korkusu o denli büyük ki, RT-PCR’ye dayalı test metodolojisini düzenleyenlerin, yanlış pozitif riskini tamamıyla göz ardı etmiş oldukları görülmektedir. Yanlış pozitiflerle şişirilen salgın ise ekonominin tamamıyla kilit altına alınması, insanların evlerine hapsedilmesi, parkta top oynamak, arkadaşlarıyla kahve içmek, tiyatro veya spor aktivitelerine gitmek, yüzmek veya bir fuara gitmek gibi insalara hayatlarında mutluluk veren her unsurun tahrip edilmesine mazaret olarak kullanılmaktadır.

© Telif Hakkı 16 Mart 2021. David Crowe 

Bu makale Coronaloji sitesi için Sn. Zehra Yıldırım tarafından çevrilmiştir.